CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ- SỔ TAY PHÒNG LAB

GIỚI THIỆU

Một thí nghiệm cơ bản được thiết lập để thực tập các kỹ thuật căn bản trong sinh học phân tử như cloning và biểu hiện, chẩn đoán sản phẩm của gene. 

Đề cương cho thí nghiệm như sau.

Mục tiêu : Tạo một protein tái tổ hợp hợp bằng cách kết hợp các gene từ hai sinh vật: một từ Escherichia coli (gst) và một gene tạo protein phát huỳnh quang màu xanh lá cây từ sứa Aequoria victoria (egfp). Biểu hiện của gene tái tổ hợp sẽ tạo ra một phân tử protein duy nhất trong vi khuẩn. Phần protein thuộc vi khuẩn Escherichia coli sẽ được sử dụng như một “tag” để tách chiết protein tái tổ hợp. Phần protein nguồn gốc từ Aequoria victoria có thể được sử dụng để phát hiện protein thông qua phát huỳnh quang.

Các bước thí nghiệm

Phần I: Thao tác DNA

(Xem hình 1)

-         Tách chiết plasmid DNA sử dụng vi khuẩn Escherichia coli có chứa vector pET - 41a.

-         Sử dụng enzyme giới hạn để cắt vector pET - 41a.

-         Sử dụng PCR để khuếch đại đoạn chèn (DNA của Aequoria victoria egfp) từ pEGFP -N1, và phân cắt DNA để tạo thành các đầu dính (sticky ends).

-         Sử dụng DNA ligase để "nối" vector và  đoạn DNA chèn với nhau.

-         Chuyển phân tử DNA tái tổ hợp vào Escherichia coli.

Phần II: Sàng lọc các vi khuẩn chuyển nạp

-         Xác định vi khuẩn biến nạp biểu hiện chính xác DNA Aequoria victoria trên protein tái tổ hợp thông qua phản ứng miễn dịch với kháng thể đơn dòng.

-         Xác định các clone dương tính bằng phản ứng PCR.

-         Tách chiết DNA từ vi khuẩn biến nạp thành công và phân cắt với enzyme giới hạn để xác nhận sự hiện diện của gene có nguồn gốc từ Aequoria victoria.

-         Xác nhận bước cuối cùng của các dòng dương tính với egfp bằng phản ứng phát huỳnh quang.

-         Kiểm tra các sai sót trình tự chuỗi DNA trên gene egfp trong quá trình PCR thông qua việc giải trình tự đoạn gene.

Phần III: Biểu hiện, sàng lọc, và tinh chế protein tái tổ hợp từ vi khuẩn

-         Sử dụng điện di SDS PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel) và phân tích western blot để xác nhận sự biểu hiện của protein tái tổ hợp.

-         Nuôi cấy lượng lớn vi khuẩn chứa đoạn DNA tái tổ hợp với isopropyl-

-         β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) để sản xuất lượng lớn protein tái tổ hợp

-         Tinh chế protein tái tổ hợp trên cột ái lực cơ chất.

-         Thực hiện định lượng protein.

-         Sử dụng tách chiết phân đoạn với sự hiện diện của SDS-PAGE để kiểm tra độ tinh khiết và tính nguyên vẹn của protein tái tổ hợp.

Phần IV: Phân tích các mức biểu hiện mRNA

-         Tinh sạch RNA tổng số từ một clone vi khuẩn dương tính.

-         Thực hiện phản ứng phiên mã ngược tạo các cDNA để định lượng các mức mRNA sau khi vi khuẩn được phản ứng với IPTG và/hoặc lactose.

 Hình 1. Sơ đồ các bước cloning

CÁC QUY TẮC AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM

Các tác nhân nguy hiểm luôn hiện diện thường trực trong suốt quá trình làm thí nghiệm cho các nghiên cứu. Các tác nhân gây ô nhiễm như các hóa chất độc hại, tia UV…Các lưu ý thận trọng cần phải được cảnh báo thường xuyên khi làm việc trong các thí nghiệm sinh học phân tử do các tác nhân thường trực tiếp hoặc gián tiếp tác dụng lên phân tử DNA gây ra các khiếm khuyết di truyền, bệnh ung thư. Để đảm bảo an toàn trong lúc làm thí nghiệm thì các nội quy cần được tuân thủ chặt chẽ.

Các quan điểm coi thường các quy tắc sử dụng máy móc, an toàn cho sức khỏe không những ảnh hưởng tới bản thân mà còn gây ra hậu quả cho những người xung quanh.

Các quy định sau cần phải tuân thủ chặt chẽ trong suốt quá trình làm thí nghiệm:

1. Không mang thực phẩm, thức uống và tổ chức ăn uống trong phòng thí nghiệm.
2. Đeo kính bảo vệ mắt khi thao tác với các hóa chất nguy hiểm dễ bay hơi, cháy nổ. Không đi dép sandals hoặc các loại giày hở bàn chân hoặc ngón chân.
3. Luôn mang găng tay khi thao tác với các hóa chất gây nguy hiểm hoặc tiềm năng gây nguy hiểm. Tháo bỏ găng tay trước khi rời khỏi phòng thí nghiệm và thay găng tay thường xuyên để tránh tạp nhiễm.
4. Tóc dài phải được buộc gọn gàng, tránh ăn mặc lượm thượm dễ gây dính hóa chất hoặc bám lửa, dây dính các tác nhân yêu cầu điều kiện vô trùng.
5. Sắp xếp vi sinh vật dùng trong chuyển gene, cloning và các tube nuôi cấy đúng nơi qui định và dán nhãn rõ ràng trước khi đem đi hấp khử trùng. Các môi trường lỏng dùng nuôi cấy vi sinh vật phải được chứa trong các bình đựng chuyên biệt có chứa chất tẩy diệt khuẩn.
6. Loại bỏ các dụng cụ thủy tinh và các mảnh vỡ của chúng đúng nơi qui định.
7. Giữ gìn ngăn nắp và sạch sẽ khu vực làm thí nghiệm. Sử dụng tủ hoặc phòng chứa các dụng cụ thiết bị dự trữ cho các thí nghiệm. Cuối ngày làm thí nghiệm thì phải dọn dẹp sạch sẽ nơi thao tác thí nghiệm, kiểm tra các thiết bị máy móc đảm bảo an toàn.
8. Mặc quần áo bảo vệ khi làm việc với các thiết bị tạo song siêu âm.
9. Tránh phơi nhiễm trực tiếp với tia UV.
10. Rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm.
11. Các hóa chất văng đổ ra ngoài phải được làm sạch ngay lập tức.
12. Cần xử lý kịp thời và nhanh chóng các sự cố xảy ra như vây đổ hóa chất lên người, đứt tay chân, cháy xém, hoặc các tổn thương khác.
13. Cần nắm vững các nơi để dụng cụ chữa cháy, dung dịch rửa mắt, vòi nước khẩn cấp, lối thoát hiểm.
14. Khi thấy người khác bị điện giật cần xử trí hợp lý như dùng các thiết bị không dẫn điện để ngắt dòng điện hoặc cấp cứu người bị sự cố.
15. Luôn di trì và bảo quản các thiết bị, máy móc trong điều kiện hoạt động tốt. Trước khi rời phòng thí nghiệm cần kiểm tra tắt các thiết bị máy móc cần thiết, khóa các bình khí gas để đảm bảo an toàn cháy nổ.
16. Không đem thú nuôi vào trong phòng thí nghiệm.
17. Thải loại các hóa chất nguy hiểm trong các bình chứa thích hợp, tránh đổ thẳng ra bồn rửa dụng cụ.
18. Cần tiêm chủng các bệnh nguy hiểm, đặc biệt là bệnh uốn ván.
19. Cần nhận biết các ký hiệu được dán nhãn trên các chai, lọ, bình chứa hóa chất để đảm bảo thao tác an toàn và chính xác.

CÁC HOẠT ĐỘNG CHUNG

-         Hoá chất : chia nhỏ và lưu trữ các hóa chất và vật tư dùng cho các thí nghiệm

-         Enzyme : chi phí mua enzyme rất tốn kém và có thể bị giảm hoạt tính bởi thời gian dài tiếp xúc với nhiệt độ phòng hoặc do tạp nhiễm. Luôn luôn sử dụng đầu tip dùng một lần cho mỗi enzyme. Giữ cho enzyme trên đá lạnh, không đặt trên rack ở nhiệt độ phòng . Luôn luôn thêm enzyme vào phản ứng như là thành phần cuối cùng , nên cho enzyme vào dung dịch đệm để tránh bị mất hoạt tính enzyme.

-         Đầu típ: có 3 loại chủ yếu với các pipette: P10, P20/P200 và P1000 ứng với các màu trắng, vàng và xanh.

-         Sử dụng các thiết bị một cách chính xác và trách nhiệm. Nếu gặp bất kỳ khó khăn với việc vận hành thiết bị xin vui lòng yêu cầu trợ giúp. Nếu thiết bị bị hư hỏng, hãy báo cáo để được sửa chữa.

-         Hãy chắc chắn hiểu được cách vận hành hợp lý các thiết bị trước khi cố gắng để thao tác chúng. Nếu chưa chắc chắn cách sử dụng, hãy hỏi một người hướng dẫn tránh gây hư hại do vận hành không đúng có thể gây nguy hiểm.

Lưu ý: Thái độ thiếu thận trọng trong việc sử dụng các thiết bị hoặc các quy định về đảm bảo an toàn sẽ gây ra hậu quả nghiêm trọng cho bản thân và những người xung quanh.

PHẦN I. THAO TÁC TRÊN DNA

Mục tiêu của thí nghiệm là dung hợp một gene của sứa với với một gene của vi khuẩn để tạo một gene tái tổ hợp. Tại sao phải tạo nên một gene tái tổ hợp? Mục đích của thí nghiệm là để tìm hiểu các quá trình hoạt động sống mà quá trình này do các gene điều khiển. 

Do đó nếu hiểu được các hoạt động biểu hiện gene có thể giúp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của khoa học sự sống. Sử dụng các công cụ sinh học phân tử cơ bản được phát triển dựa trên vi khuẩn E. coli có thể giúp chúng ta nghiên cứu và áp dụng cho các đối tượng khác có cấu trúc phức tạp hơn.

Vi khuẩn E. coli đã được giải trình tự với genome đơn giản và dễ nghiên cứu. Do đó, các nhà khoa học đã và đang khai thác vi khuẩn E.coli như công cụ để sản suất DNA và sản suất các sản phẩm biến dưỡng khác phục vụ lợi ích con người.

Trong ứng dụng thực tiễn của công nghệ sinh học, chúng ta có thể đưa một gene mã hóa một protein khó tinh sạch từ một sinh vật khác vào E.coli, quá trình này giúp làm giảm chi phí và gia tăng độ tinh sạch của protein, bênh cạnh đó có thể tránh vấn đề về đạo đức khoa học do không cần phải giết mổ hoặc lấy nội tạng từ người và động vật để tách chiết và tinh sạch. Ví dụ, protein tái tổ hợp đầu tiên được sản xuất là insulin người và thương mại hóa trong những năm đầu thập niên 80 giúp điều trị bệnh đái tháo đường.

Các kỹ thuật căn bản sẽ cung cấp thông tin các kỹ năng cloning, biểu hiện và tinh sạch các protein tái tổ hợp. Giúp chúng ta có thể thăm dò chức năng một protein  là sản phẩm của một gene bất kỳ, tất nhiên gene này phải có một trình tự xác định. Bên cạnh đó, khi chúng ta hiểu rõ các kỹ thuật căn bản và có kiến thức nền vững chắc sẽ giúp chúng ta tiếp cận dễ dàng hơn các kỹ thuật tiên tiến và phức tạp.

Thực tế có một số sinh vật khác cũng được sử dụng phổ biến trong gene cloning và biểu hiện protein tái tổ hợp, ví dụ như chủng vi khuẩn Bacilus, sinh vật nhân thật (eukaryote) như con men, nấm, thực vật, tế bào côn trùng nuôi cấy nhân tạo, tế bào động vật hay thậm chí là một cơ thể động vật sống. Nhiều kỹ thuật DNA tái tổ hợp được giới thiệu ở đây có thể áp dụng trên các đối tượng khác ngoài E.coli.

Trong thí nghiệm được mô tả trong tài liệu này, gene mã hóa cho một protein phát huỳnh quang sẽ được cloning và biểu hiện, ký hiệu là egfp. Gene egfp là một biến thể của protein phát quang từ sứa biển nhưng khả năng phát sáng được tăng cường thêm giúp dễ dàng quan sát. Các gene mã hóa và tạo ra các protein phát quang hiện đang được sử dụng như các gene đánh dấu (“reporter gene”), điều này có nghĩa là chúng ta có thể định vị được vị trí cũng như cách thức hoạt động của protein. Những gene đánh dấu này phải biểu hiện kiểu hình chuyên biệt cũng như dễ dàng thao tác có thể được sử dụng trong các nghiên cứu về hoạt động của promoter hoặc định vị protein trong các điều kiện thí nghiệm có kiểm soát, mô hoặc giai đoạn phát triển khác nhau. 

Cấu trúc của các DNA tái tổ hợp (vector) được thiết lập với một gene đánh dấu được chèn vào vùng có chứa promoter cần quan tâm, sau đó DNA tái tổ hợp sẽ được chuyển nạp hoặc lây nhiễm và các ký chủ (tế bào nuôi cấy hoặc sinh vật nguyên vẹn). Trong tài liệu này, gene egfp không được sử dụng làm gene đánh dấu mà sử dụng như gene thông thường để tiện lợi trong việc cloning và phân tích nhằm giúp chúng ta nắm được các kỹ thuật căn bản về DNA tái tổ hợp cũng như biểu hiện và phân tích sản phẩm của gene là protein.

Tài liệu tham khảo:

Yang T, Cheng L, Kain SR. Optimized codon usage and chromophore mutations provide enhanced sensitivity with the green fluorescent protein. Nucl. Acids Res. 1996; 24(22):4592–4594.

BÀI THỰC HÀNH SỐ 1

Cách sử dụng micropipette: mục tiêu là tập cách sử dụng thành thạo các loại micropipette trong các thao tác thí nghiệm. Điều quan trọng trong việc sử dụng thành thạo và chính xác các trang thiết bị trong phòng thí nghiệm là phải làm quen môi trường, không gian, nơi bố trí các trang thiết bị trước khi bắt tay vào thực hiện các thí nghiệm.

Nắm vững đặc tính các khu làm việc nhằm hạn chế tạp nhiễm khi thay đổi hoặc di chuyển không gian làm việc cho phù hợp với từng giai đoạn thí nghiệm. Trước khi bắt tay vào một thí nghiệm cụ thể cần phải lập bảng chi tiết các thiết bị, hóa chất cần thiết phục vụ cho thí nghiệm. Ghi nhãn cẩn thận bằng ký hiệu riêng tùy theo sự thuận tiện cho công việc.

Micropipette là các thiết bị được dùng để đo một dung tích chất lỏng rất nhỏ (0.1~1000ul) thường hay được sử dụng trong các thí nghiệm liên quan đến sinh học phân tử. Có 5 loại micropipette thường được sử dụng với dãy dung tích như sau:

Loại micropipette	Dung tích sử dụng (ul)
P2	0.1-2
P10	0.5-10
P20	2-20
P200	20-200
P1000	200-1000

Điều chỉnh lượng dung dịch cần thao tác là việc là cần thiết đầu tiên đối với việc sử dụng micropipette. Các micropipette thường sử dụng các đầu tip khác nhau nhưng có một số sử dụng chung loại đầu tip ví dụ như P20 và P200. Sử dụng hình minh họa dưới đây và các hướng dẫn để thực hành cách điều chỉnh lượng chất lỏng cần lấy, thực hành đến khi sử dụng thông thạo và tự tin.

Chỉnh các dung tích cho micropipette

P1000 với các dung tích từ 200-1000ul 1 0 0 0 5 2 0 0 0 1ml=1000ul 0.5ml=500ul 0.2ml=200ul P200 với dung tích từ 20-200ul 2 1 0 0 5 3 0 0 2 0.2ml=200ul 0.15ml=150ul 0.032ml=32ul P20 với dung tích từ 2-20ul 2 1 0 0 5 2 0 5 5 0.02ml=20ul 0.0155ml=15.5ul 0.0025ml=2.5ul P10 cho dung tích từ 0.5-10ul 1 0 0 0 5 0 0 5 5 0.01ml=10ul 0.0055ml=5.5ul 0.0005ml=0.5ul P2 cho dung tích từ 0.1-2ul 2 1 0 0 5 1 0 0 0 0.002ml=2ul 0.0015ml=1.5ul 0.0001ml=0.1ul

1. Điều chỉnh dung tích bằng cách giữ pipette bằng một tay và tay còn lại vặn vòng điều chỉnh. Không vặn vượt quá giới hạn trên hay giới hạn dưới của bất kỳ micropipette nào vì dễ gây hư hỏng làm không chính xác thể tích đo đạc.
2. Gắn đầu tip vào đầu micropipette, để chắc chắn đầu típ đã được gắn chặt và kín thì nên nhấn đầu tip kết hợp với việc xoay nhẹ.
3. Ấn pittông xuống nấc đầu tiên đến khi cảm thấy được điểm dừng để tống khí ra ngoài, lượng khí thoát ra ứng với thể tích chất lỏng cần hút lấy.
4. Cho đầu tip và dung dịch ở độ sâu từ 2-5mm và hút lấy chất lỏng. Nếu nhúng đầu típ quá sâu dễ làm dung dịch dính bề mặt ngoài đầu típ gây ra sai sót khi đưa đầu tip này vào dung dịch khác cần phối trộn.
5. Thả đầu ngón tay giữ pittông nhẹ nhàng và từ từ về vị trí gốc ban đầu (vị trí khi chưa được nhấn để hút dung dịch).
6. Chờ 1 giây trước khi lấy đầu tip ra khỏi dung dịch để chất lỏng được hút đầy đủ dung tích cần lấy. Tránh hút nhanh dễ tạo bọt khí trong dung dịch hút lấy.
7. Nhấn pittông để bơm dung dịch ra khỏi tip.
8. Để tránh tình trạng tạp nhiễm các dung dịch hóa chất cũng như các enzyme chúng ta nên sử dụng đầu tip mới cho mỗi lần bơm hút các dung dịch.

Thực tập nhuần nhuyễn các thao tác với micropipette bằng cách hút lấy các thể tích dung dịch theo giả định đến khi tự tin và thao tác chính xác.

Thực hành: chuẩn bị pha loãng dung dịch BSA (protein albumin huyết thanh của bò)  

Sử dụng 15ul dung dịch BSA với nồng độ 1mg/ml. Chuẩn bị một chuỗi dung dịch pha loãng để tạo các dung dịch BSA nồng độ chuẩn trong 5 ống tube (dán nhãn 1-5) theo sơ đồ ở bảng và hình. Trộn kỹ dung dịch trước khi thực hiện việc pha loãng bằng pipette.

Sơ đồ chuỗi pha loãng

Ống tube	Pha loãng	Nồng độ protein BSA
1	12.5ul dung dịch mẹ (stock) + 37.5ul dH2O. Pha loãng 1/4.	250ug/ml
2	25ul từ tube 1 + 25ul dH2O. Pha loãng 1/2.	125ug/ml
3	25ul từ tube 2 + 25ul dH2O. Pha loãng 1/2.	63ug/ml
4	25ul từ tube 3 + 25ul dH2O. Pha loãng 1/2.	31ug/ml
5	25ul từ tube 4 + 25ul dH2O. Pha loãng 1/2.	16ug/ml

1.       Lấy một mảnh nitrocellulose (luôn mang găng tay khi cầm nắm nitrocellulose) và đặt lên miếng giấy Whatman 3 MM (Clifton, NJ).

2.       Nhỏ một giọt 2ul dH₂O (đối chứng) và mỗi dung dịch BSA pha loãng.

3.       Để mảnh nitrocellulose khô tự nhiên.

4.       Sau khi các giọt dung dịch khô hoàn toàn, thực hiện nhuộm bằng cách đặt vào khay hoặc đĩa Petri hình vuông, phủ lên một lớp dung dịch nhộm amido màu đen. Nhuộm trong khoảng thời gian 1-2 phút, lắc nhẹ khi nhuộm.

5.        Đổ bỏ dung dịch nhuộm (đổ trở lại chai đựng cũ vì có thể tái sử dụng) và cho phủ lên màng nitrocellulose dung dịch methanol-acetic acid để rửa thuốc nhuộm và lắc nhẹ. Thay dung dịch rửa sau mỗi 5 phút đến khi màu nền màng nitrocellulose trở nên trắng.

6.       Đặt màng nitrocellulose lên giấy 3MM để làm khô. So sánh cường độ các điểm dung dịch pha loãng. Cường độ màu của các điểm sẽ giảm dần sau mỗi pha loãng (màu giảm một nửa cho đến điểm nhuộm cuối cùng).

BÀI THỰC HÀNH 2

Tinh sạch và phân cắt DNA plasmid (vector): Mục tiêu là ly trích DNA plasmid pET-41a, đây là một vector sử dụng để biểu hiện gene mục tiêu mong muốn. Ly trích DNA plasmid có thể sử dụng kit QIAprep Spin Miniprep. Phương pháp ly trích thông qua quá trình ly giải tế bào vi khuẩn bởi dung dich có tính kiềm (alkaline). Phương pháp ly trích này giúp phá vỡ tế bào và tách DNA plasmid khỏi DNA chromosome. Sau đó plasmid được hấp phụ bởi lớp silica, bước này giúp tinh sạch DNA plasmid khỏi protein tế bào cũng như các thành phần khác. DNA plasmid sẽ được đem đi định lượng sau khi hoàn tất việc ly trích và tính sạch.

Trong sinh học phân tử, vi khuẩn E.coli được sử dụng như một nhà máy tổng hợp lượng lớn các clone DNA theo mong muốn. Bài thực hành này sẽ giúp chúng ta tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coli phục vụ cho các thí nghiệm invitro.

Plasmid DNA được clone và đưa vào vi khuẩn để nhân lên về số lượng. Các tế bào vi khuẩn là các phức hợp của DNA plasmid, DNA chromosome, protein, màng và thành tế bào (cell wall). Thủ thuật trong việc tách chiết và tinh sạch DNA plasmid là tách DNA plasmid khỏi DNA chromosome cũng như các thành phần khác của tế bào.

Ly giải Alkaline  

Phương pháp phổ biến nhất hiện nay trong việc tách chiết DNA plasmid là ly giải alkaline, phương pháp này được phát triển bởi Birnboim và Doly. Các tác giả khai thác đặc tính tự nhiên của DNA plasmid như siêu xoắn, kích thước khá nhỏ để tách plasmid khỏi các thành phần khác của tế bào.

Đầu tiên tế bào vi khuẩn sẽ bị phá vỡ dưới điều kiện pH kiềm (alkaline), dưới điều kiện này, cả DNA thuộc chromosome và plasmid sẽ được phóng thích và biến tính dưới dạng sợi đơn (single strand). DNA biến tính có thể bắt cặp trở lại ở điều kiện pH trung tính với điều kiện không để trong môi trường kiềm quá lâu.

Do DNA vi khuẩn ở dạng siêu xoắn nên 2 mảnh của DNA plasmid bằng cách nào đó vẫn còn cuộn vào nhau trong quá trình thao tác dưới điều kiện pH kiềm. Điều này giúp cho DNA plasmid dễ dàng bắt cặp trở lại. Bên cạnh đó, DNA chromosome kích thước lớn, vẫn còn lien kết với các thành phần khác của tế bào như protein, lipid nên sẽ bị loại khỏi dung dịch chứa plasmid thông qua kết tủa kết hợp với biến tính protein, lipid. Bước này được thực hiện bằng cách sử dụng muối potassium acetate.

DNA chromosome và các thành phần khác DNA plasmid thường được loại bỏ thông qua bước ly tâm hoặc lọc dung dịch. RNA trong dung dịch ly trích thông thường sẽ bị phân hủy bằng cách thêm vào enzyme RNAse trong suốt quá trình ly giải alkaline. Sợi đôi DNA plasmid sẽ được kết tủa bằng ethanol hoặc có thể được tinh sạch ở mức cao bằng phương phap sắc ki trao đổi ion hoặc chạy mẫu với màng silica. Bước 5-8 trong phương pháp ly trích DNA plasmid liên quan đến phần thao tác sử dụng dung dịch alkaline để ly giải tế bào vi khuẩn.

Hấp phụ silica

Mặc dù nhiều thành phần tế bào bị loại bỏ trong suốt quá trình ly giải alkaline, tuy nhiên vẫn còn một số protein và các chất biến dưỡng khác vẫn còn được giữ lại trong dung dich ly trích. Để đạt được độ tinh sạch cao của DNA plasmid chúng ta cần phải tiếp tục tinh sạch DNA plasmid thông qua sử dụng màng silica để hấp phụ chọn lọc plasmid. DNA plasmid được hấp phụ có chọn lọc dưới điều kiện nồng độ muối cao đã được tối hảo cho plasmid. Các chất tạp không cần thiết sẽ bị rửa bỏ, sau đó DNA plasmid tinh sạch sẽ được tách khỏi màng dưới điều kiện nồng độ muối thấp.

Định lượng DNA

Việc định lượng DNA được thực hiện thông qua đọc một thể tích dung dịch chứa DNA tại bước sóng hấp thụ 260nm. Hệ số trung bình của sợi đôi DNA tinh khiết đạt giá trị 50ug/ml, điều này có nghĩa là cứ mỗi đơn vị hấp thụ bước song 260nm của sợi DNA dây đôi tương ứng với 50ug DNA cho 1 ml. Để đánh giá độ tinh khiết của mẫu DNA, tỉ lệ hấp thụ bước song 260/280 được sử dụng. Tỉ lệ 260/280 xấp xỉ giá trị 1.8 là lý tưởng. Các mẫu DNA với tỉ lệ 260/280 cao hơn 1.8 có thể do tạp nhiễm RNA, tỉ lệ thấp hơn 1.8 do tạp nhiễm protein. 

GIỚI THIỆU VỀ VECTOR BIỂU HIỆN GENE MỤC TIÊU

Nhìn chung thì các vector dùng cho cloning là các plasmid dung để nhân số lượng đoạn DNA mục tiêu. Các vector này được nhân lên với số lượng lớn thông qua các vi khuẩn E.coli. Các vector cloning thường chứa một polylinker (nơi chứa nhiều vị trí nhận dạng của các enzyme cắt hạn chế RE), điểm này thường được dùng để chèn đoạn DNA mục tiêu vào trong vector. Vector cloning cũng chứa marker chọn lọc, thường là gene kháng kháng sinh và hiện nay có thêm các gene chọn lọc mới như mannose, tryptophane v.v. Gene marker chọn lọc này giúp vi khuẩn chứa plasmid sống được trong môi trường chọn lọc. Bên cạnh đó vector cloning cũng có thể chứa marker sàng lọc như β-galactosidase. 

Các vector biểu hiện là những vector chuyện biệt của vector cloning. Vector biểu hiện được thiết kế để cho phép thực hiện quá trình phiên mã và dịch mã của gene mục tiêu. Các vector biểu hiện có các đặc điểm chung của các vector cloning thông thường dùng trong việc nhân số lượng DNA như các polylinker và các marker chọn lọc. Bên cạnh đó các vector biểu hiện cũng có thêm promoter, điểm liên kết với ribosome, mã khởi đầu (start codon ATG), một đoạn đánh dấu chuyên biệt dùng để tinh sạch bằng kháng thể hoặc các phản ứng liên kết khác.

Học thuyết trung tâm Central Dogma

CÁC NGUYÊN LÝ SỬ DỤNG VECTOR BIỂU HIỆN GENE MỤC TIÊU

Để hiểu được chức năng và hoạt động của các vector biểu hiện gene thì phải nắm được nguyên lý của học thuyết trung tâm Central Dogma trong sinh học phân tử.Đầu tiên, đoạn gene DNA phải được phiên mã thành mRNA, sau đó đoạn mã hóa trên mRNA sẽ được dịch mã thành protein (hình trên). Sơ đồ nhìn có vẻ đơn giản nhưng thật ra có rất nhiều bước trung gian xảy ra và khoa học vẫn đang khám phá nhiều cơ chế phức tạp đằng sau các bước chính của học thuyết trung tâm.

Một ví dụ đơn giản nhất là RNA polymerase gắn vào promoter của gene cần biểu hiện và thực hiện việc phiên mã tạo ra phân tử mRNA. Quá trình phiên mã sẽ kết thúc tại điểm mang chuỗi trình tự kết thúc (terminator). Sau đó các ribosome sẽ gắn vào các mRNA tại điểm chuyên biệt (RBS=ribosome binding site). Các ribosome di chuyển dọc theo phân tử mRNA, lúc này các phân tử tRNA chịu trách nhiệm cho việc giải mã mRNA thông qua việc mang các amino acid ứng với các bộ ba mã hóa trên mRNA, các amino acid nay được xúc tác gắn kết lại với nhau trong bộ máy ribosome tạo ra chuỗi polypeptide. Chuỗi mã khởi đầu thường là AUG trên mRNA (trên DNA là ATG) mã hóa cho amino acid đầu tiên thường là methionine, các codon stop TAA, TAG và TGA dùng để kết thúc quá trình dịch mã.  

CÁC VECTOR BIỂU HIỆN

Vector pET-41a được sử dụng như một ví dụ để phân tích cấu trúc một vector biểu hiện. Đây là vector sử dụng gene chọn lọc kháng lại kanamycin và gene gst (glutathione-S-transferase) như là một tag đánh dấu. Điểm polylinker nằm ở vùng downstream (3’) của gene gst do đó không mang codon stop hay tín hiệu kết thúc cuối gene gst. Khi gene mục tiêu egfp được clone vào điểm polylinker thì nó sẽ biểu hiện như là một protein dung hợp với gene gst để tạo nên một protein tái tổ hợp GST::GFP. Chúng ta sẽ khám phá cách tạo ra protein tái tổ hợp dạng như thế này để giúp cho quá trình tinh sạch protein EGFP được thuận lợi ở các bước tiếp theo.

Sự biểu hiện của gene gst là sản phẩm của gene tái tổ hợp trong cấu trúc của một vector dưới sự điều khiển của promoter T7 và promoter này được cảm ứng bởi isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Bình thường thì T7 được cảm ứng bởi đường lactose và IPTG hoạt động như một chất giả tính chất của lactose để cảm ứng sự biểu hiện của promoter T7 và chất này không bị phân cắt bởi enzyme β-galactosidase. Sự cảm ứng xảy ra do vector pET-41a sử dụng 2 thành phần của lac-operon là lac-operator và lacI gene để điều hòa qua trình phiên mã.

vector pET-41a và operon Lac

HƯỚNG PHIÊN MÃ VÀ KHUNG ĐỌC MỞ CỦA VECTOR

Khi thực hiện cloning một gene mục tiêu nào đó và biểu hiện nó thông qua một vector thì yếu tố quan trọng là cả gene mục tiêu và khung đọc của vector phải đúng chiều đọc của quá trình phiên mã để quá trình dịch mã sau đó diễn ra chính xác và protein mục tiêu được biểu hiện đúng chức năng.

Hướng của vector

Để chắc chắn gene mục tiêu được chèn vào đúng vị trí và chiều hướng của khung đọc mở. Để thực hiện điều này chúng ta dùng phương pháp cloning theo hướng đã được cấu trúc trước trên vector. Với phương pháp cloning này, điểm polylinker của vector được phân cắt bởi 2 enzyme RE (restriction enzyme) tạo ra các đầu cuối không tương thích nhau dưới dạng dính so le và một phần đoạn nhỏ nằm giữa điểm cắt của RE sẽ bị loại bỏ. Đoạn gene mục tiêu cần chèn vào vector sẽ được phân cắt bởi 2 enzyme RE cùng loại sau đó được gắn với vector. Cloning theo phương pháp này có 2 điểm cải tiến so với chỉ sử dụng một loại enzyme RE:

(1) Các đầu cuối dạng so le không tương thích sẽ ngăn chặn việc vector tự gắn vào nhau mà không chèn được đoạn gene mục tiêu vào.

(2) Hướng của đoạn gene chèn vào đã được cấu trúc trước chỉ theo một chiều duy nhất, chiều đầu cuối 5’ của đoạn gene chèn sẽ chỉ có thể gắn vào một đầu cắt của vector mà thôi. Do chúng ta đã biết trước trình tự của cả vector và đoạn gene chèn vào nên chúng ta cũng sẽ biết được sản phẩm gene tái tổ hợp sẽ được phiên mã hay dịch mã theo hướng nào một cách chính xác.

Ví dụ trong trường hợp vector đang dùng pET-41a sẽ được cắt bởi 2 enzyme RE có trình tự nhận biết bên trong điểm polylinke là các enzyme NcoI và NotI. Sau đó thì gene egfp sẽ được phân cắt sử dụng cùng 2 enzyme RE trên. Sau đó đoạn gene chèn sẽ được nối vào vector biểu hiện.