Lập bản đồ tái tổ hợp và thực hiện gene cloning

Các tác nhân gây đột biến như các tia bức xạ hay hóa chất làm thay đổi trình tự gene một cách ngẫu nhiên ở bất kỳ vị trí nào trên bộ gene (genome). Có nhiều cách để lập bản đồ của một đột biến trên nhiễm sắc thể và sau đó thì có thể clone gene mục tiêu đã xác định được vị trí. Hình sau mô tả phương pháp gene cloning dựa bào bản đồ gene.

Phương pháp này có ưu điểm là khai thác tính ít khác biệt giữa trình tự DNA của hai giống có quan hệ gần gũi với nhau trong cùng một loài nhưng có vài đặc điểm khác nhau. Tính khác biệt này tạo ra các nòi sinh thái - ecotype, ví dụ như ở cây Arabidopsis thì có các ecotype như Col-0, Ler và WS. Sự khác nhau các vị trí di truyền giữa hai ecotype gọi là các trình tự đa hình. Các trình tự đa hình này có thể được dùng như những marker di truyền (genetic marker) để phân tích tính đa hình giữa các cá thể hay các ecotype.  

Nếu vị trí của các đa hình được biết trước khi vị trí đột biến được lập bản đồ thì hãy xác định sự liên kết di truyền chặt chẽ giữa gene đột biến và marker chuyên biệt. Điều này cho phép các nhà di truyền học xác định được vị trí của gene đột biến trên bản đồ di truyền. Một khi vị trí gene trên bản đồ đã được xác lập thì các vị trí xung quanh sẽ được xác định trình tự để so sánh với kiểu gene của genome kiểu hoang dại (wild type).

Chúng ta sẽ sử dụng hình trên như một ví dụ. Giả sử chúng ta có một đột biến làm chậm thời gian ra hoa. Trong ví dụ này thì hóa chất EMS (ethylmethane sulfonate) được sử dụng để tạo ra đột biến trên một cá thể cây Arabidopsis thaliana thuộc ecotype Columbia (Col).

Cây đột biến này sẽ được dùng để lai với cây hoang dại từ một ecotype khác là Ler (Landsberg erecta). Cả hai ecotype này giống nhau về di truyền đến 99% và có thể được lai tạo với nhau tạo ra các cá thể lai Col/Ler. Nếu đột biến làm chậm thời gian ra hoa là tính trạng lặn thì thế hệ F1 sẽ tạo ra 100% cây con có kiểu hình hoang dại.

Mặc dù sự khác biệt về kiểu hình ở F1 rất khó để nhận biết nhưng các cây F1 vẫn mang hai nửa bộ nhiễm sắc thể từ cả ecotype Col và Ler. Trong quá trình giảm phân của thế hệ F1, sự trao đổi chéo (crossing over) sẽ xảy ra và hòa trộn các đoạn nhiểm sắc thể từ các cây cha mẹ Col và Ler để tạo ra quần thể F2 có thể được dùng để lập bản đồ. Mỗi cá thể của quần thể F2 có sự tổ chức nhiễm sắc thể khác nhau.  

Một vài ví dụ được nêu ra ở đây để tham khảo. Do các đột biến là tính trạng lặn nên chỉ có 25% cây con F2 sẽ cho kiểu hình đột biến khác với kiểu hình cha mẹ. Những cây đột biến này chứa nhiều thông tin rất hữu ích và sẽ được giữ lại làm vật liệu cho các thí nghiệm phân tích di truyền. Các cây khác có thể được loại bỏ.

Bộ gene của cây Arabidopsis có 5 nhiễm sắc thể nên ban đầu người ta có thể sử dụng 10 marker đa hình. Trong số này thì mỗi một marker ứng với một nhánh nhiễm sắc thể, như vậy một nhiễm sẽ có hai nhánh với tâm động ở giữa và mỗi nhánh này ứng với một marker được sử dụng. Các marker này sẽ được phân tích xem chúng có phân ly cùng với kiểu hình đột biến hay không. Một yếu tố quan trọng trong phân tích di truyền của các marker này là allele đột biến chỉ có thể nằm trên đoạn nhiễm sắc thể thuộc về cây Col đã bị đột biến trước khi đem lai tạo.

Bước kế tiếp là xác định một gene làm marker có vị trí vật lý gần với gene bị đột biến và cùng phân ly với gene đột biến dưới dạng liên kết chặt. Marker gene này có thể nằm trên nhiễm sắc thể thuộc cây Col hay cũng có thể thuộc cây Ler.

Để xác định các marker di truyền cùng phân ly với gene đột biến thì phải thực hiện việc tách chiết DNA từ cây đột biến và cây cha mẹ. Một cách dễ dàng để xác định sự đa hình giữa cây Col và cây Ler thì trước hết khuếch đại đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR với một marker chuyên biệt, ví dụ marker A chẳng hạn. Sau đó sử dụng các enzyme RE (enzyme cắt hạn chế) để phân biệt sự khác biệt giữa cây Col và Ler tại vị trí marker A. Enzyme RE chỉ cắt một trong 2 sản phẩm khuếch đại PCR.

Kỹ thuật này gọi là kỹ thuật phân tích đa hình dựa vào sự phân cắt các sản phẩm khuếch đại – CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence). Từ ví dụ trên thì kết quả phân cắt bởi emzyme RE tạo ra hai band hình nhỏ từ sản phẩm khuếch đại với DNA có nguồn gốc từ cây Col. Trong khi sản phẩm khuếch đại có nguồn gốc từ DNA cây Ler chỉ cho một band hình có kích thước lớn hơn. Kết quả này được giải thích là do enzyme RE chỉ nhận dạng và phân cắt được sản phẩm khuếch đại có nguồn gốc từ cây Col tại marker A chuyên biệt, vị trí marker A này không hiện diện trên cây Ler.

Nếu một cây F2 đồng hợp tử tại vị trí marker A thuộc cây Col thì sản phẩm phân cắt chỉ cho 2 band nhỏ nhơn. Tương tự như vậy thì cây đồng hợp tử thuộc cây Ler chỉ cho 1 band lớn hơn. Tuy nhiên, nếu cây con F2 là dị hợp tử, chúng ta có thể thấy sản phẩm phân cắt sẽ cho ra 3 band hình bởi vì cặp nhiễm sắc thể với một nhiễm sắc thể mang marker A trong khi nhiễm sắc thể còn lại thì không.

Ghi nhớ rằng gene mục tiêu quan tâm bị đột biến mang tính trạng lặn có nguồn gốc từ nhiễm sắc thể của cây Col do đó kiểu hình của cây chỉ được nhận dạng khi kiểu gene ở trạng thái đồng hợp tử. Do đó chúng ta có thể loại trừ các cây không cho đặc điểm đồng hợp tử cho gene đột biến và kiểu hình tương ứng.

Nếu có nhiều cây trong quần thể không mang gene đột biến ở dạng đồng hợp tử khi phân tích với marker A thì chúng ta có thể xem xét rằng gene bị đột biến không có vị trí gần với marker A do đó không tạo ra liên kết chặt chẽ cùng nhau. Chúng ta có thể sử dụng marker di truyền khác để phân tích.
Trên một vài phương diện thì chúng ta hy vọng có thể tìm thấy liên kết  giữa một marker di truyền và kiểu hình. Điều này có nghĩa là gene bị đột biến có nguồn gốc từ cây Col có vị trí rất gần với marker do đó chúng ta có thể xác định được gene bị đột biến nằm ở vị trí nào của nhiễm sắc thể số mấy trong bộ gene.

Để xác định vị trí của gene đột biến chính xác hơn trên nhiễm sắc thể thông qua kỹ thuật fine-mapping, chúng ta có thể lựa chọn các marker từ bản đồ có vị trí lân cận với marker liên kết với gene thông qua các phân tích đã đề cập bên trên.
Quá trình tương tự như kỹ thuật CAPS tiếp tục được sử dụng. Sử dụng quần thể F2 chúng ta có thể phân tích CAPS để tìm kiếm các cá thể chứa các vùng trình tự đồng hợp tử cho gene đột biến nguồn gốc từ cây Col ứng với kiểu hình đột biến.

Điều này cho thấy rằng trong quá trình trao đổi chéo chỉ một vùng nhỏ DNA thuộc cây Col được duy trì ở trạng thái đồng hợp tử tại vị trí gene đột biến. nếu may mắn thì chúng ta có thể tìm thấy một cá thể từ quần thể đem phân tích có chứa một đoạn nhỏ DNA ở dạng đồng hợp tử, đương nhiên thì đoạn DNA này có nguồn gốc từ cây Col và mang gene đột biến, các đoạn DNA xung quanh gene đột biến này có thể có nguồn gốc từ cây Ler.

Tuy nhiên nhiều khả năng chúng ta sẽ tìm thấy các cá thể đột biến mang dạng đồng hợp tử tại một số vị trí với DNA thuộc cây Col, sau đó là đồng hợp tử đoạn DNA thuộc cây Ler hoặc cũng có thể mang vùng nhiễm sắc thể dạng dị hợp tử. Nếu chúng ta có thể sử dụng thông tin từ cá thể này với thông tin từ một cá thể khác chứa DNA từ cây Col và cây này cũng chứa DNA từ cây Ler nhưng vẫn mang kiểu hình đột biến (kiêu gene đồng hợp tử tại vị trí đột biến) thì chúng ta có thể tổng hợp thông tin với nhau từ cả 2 cây này sau đó loại trừ thông tin từ các vùng nhiễm sắc thể của bất kỳ cây đột biến nào mang kiểu gene dị hợp hay đồng hợp có nguồn gốc từ cây Ler.

Khi chúng ta đã xác định được vùng fine-mapping, chúng ta có thể sử dụng phương pháp khác từ cơ sở dữ liệu cây Arabidopsis. Sử dụng trình tự toàn bộ genome tại trang www.arabidopsis.org chúng ta có thể kiểm tra trình tự của kiểu hình hoang dại của cây Col so với đoạn gene đột biến đã được xác định vị trí và trình tự như trên.

Bây giờ thì chúng ta phải xem xét liệu có bất cứ sự khác biệt nào giữa 2 đoạn trình tự DNA từ cây đột biến và trình tự từ cơ sở dữ liệu. Tìm xem liệu có mối quan hệ giữa kiểu hình đột biến với sự thay đổi trình tự của gene bị đột biến hay không. Nếu gene đột biến tạo kiểu hình tương ứng thì ta có thể sử dụng DNA kiểu hoang dại để phục hồi kiểu hình hoang dại từ cây cho kiểu hình đột biến. Để làm điều này thì chúng ta có thể chuyển gene với trình tự gene bình thường vào cây đột biến và quan sát kiểu hình trên các cây con thế hệ sau.

Nếu kiểu hình cây đột biến được khôi phục trở về kiểu hình hoang dại thì kết quả này là bằng chứng thuyết phục rằng kiểu hình đột biến tạo ra cây ra hoa chậm là do gene bị đột biến làm thay đổi trình tự làm thay đổi chức năng của gene.